淋巴細胞分離簡述

     作為一種重要的免疫細胞，淋巴細胞的數目及功能狀態反應了機體所處的免疫狀態，與一些先天或后天的免疫缺陷性疾病、傳染性疾病以及惡性腫瘤等免疫功能障礙有關的疾病有密切關聯。因此，研究淋巴細胞的免疫狀態對多種疾病的診斷、預防及治療都有著極為重要的意義。而淋巴細胞分離是研究淋巴細胞功能狀態及其在細胞免疫中作用的關鍵步驟。

淋巴細胞分離來源主要是外周血（或淋巴組織細胞懸液），目前常規的淋巴細胞分離方法有基于淋巴細胞分離液的密度梯度離心法、HES沉降法、以及基于抗原抗體結合的磁珠與流式細胞分離法。本文就現在常用的幾種淋巴細胞分離方法及其特點做一簡要綜述。

1、密度梯度離心法

該方法采用淋巴細胞分離液進行進行密度梯度離心分離得到淋巴細胞。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形狀和比重與其他細胞不同從而導致各種細胞具有不同的密度，淋巴細胞分離液即是一種根據細胞密度差異，借助離心產生的重力加速度，使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離純化的常用試劑。常用的淋巴細胞分離液有Ficoll淋巴細胞分離液和Percoll淋巴細胞分離液。

1.1. Ficoll-Hypaque密度梯度離心法

Ficoll是一種中性的蔗糖的多聚體，吸水性強，平均分子量為400,000，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點。單一的Ficoll溶液分子量大，高濃度時增加粘度易導致細胞聚集，因此常用的Ficoll淋巴細胞分離液采用了降低Ficoll濃度，同時加入泛影葡胺增加密度的Ficoll-Hypaqu混合溶液，其密度在1.077左右，近于等滲，適用于分離外周血淋巴細胞和單個核細胞（PBMC，外周血淋巴細胞和單個核細胞比重為1.075左右）^【1】。利用該分離液作密度梯度離心時，各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集，紅細胞與粒細胞由于密度較大故沉于分層液的底部，淋巴細胞和單核細胞（PBMC）的比重與分層液比重相近，故位于分層液界面上。^【2，3】

 Ficool淋巴細胞分離液是一種經典的淋巴細胞分離試劑，分離得到的PBMC純度在90％以上，收獲率可達80～90％，活細胞百分率在95％以上。然而因其固定的密度，故只適用于PBMC、脊髓干細胞、骨髓干細胞的分離。

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供應商               品名                    貨號        規格

MP Biomedicals   Lymphocyte Separation Medium - LSM™  0850494X    100 mL  

biomarket       LymphoprepTM分離液          1114544      250ml

1.2. Percoll密度梯度離心法：

Percoll成分為硅化聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的顆粒，滲透壓很低，粘度也很小，不穿透生物膜，對細胞無毒害無刺激，不引起細胞聚集，可形成高達1.3g／ml密度。特別的是percoll的顆粒直徑大小不同，可在離心過程中自然形成連續的密度梯度，從而將不同密度的細胞分離出來。而且Percoll擴散常數低，所形成的梯度十分穩定，配置不同濃度（密度）時僅需通過用PBS(1x)或組織培養液稀釋即可獲得，廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。采用Percoll細胞分離液得到的細胞可直接用于基于熒光標記的細胞分選。^【4】

因此，Percoll細胞分離液不僅適用于外周血中PBMC的分離（單個核細胞和淋巴細胞分別處于不同的密度層），而且能將全血中的多種細胞分離出來（各種細胞處于相應的梯度層），還可根據不同實驗室需要配置所需的連續密度梯度，分離特定的細胞或亞細胞組分。初步分離得到的PBMC可根據需要不同密度梯度的不連續梯度離心方法進行進一步細胞純化，如純化淋巴母細胞和除去死細胞以及富含NK活性大顆粒淋巴細胞(LGL)的純化。^【5】

常用percoll濃度密度換算（Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9：1的比例混合，此時溶液 為100％ Percoll，比重是1.127）

Percoll濃度(％)    70       60       50       40       30        20 

比重g／ml       1.090  1.077    1.067   1.056   1.043     1.031

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供應商    貨號           規格

GE    17-0891-01         1 L

GE    17-0891-01         100 ml

1.3. Iodixanol梯度離心法

Iodixanol是一種化學成分為碘海醇（Iohexo1）的白色、高親水性粉劑，可以配成型的非離子密度梯度分離液。分子量為821，密度為2.1 g/ml，是非離子型的、對細胞無毒性的化合物，可用于細胞、細胞器、生物大分子、病毒等各種生物物質的分離或提純^【6】。該分離液的密度可以通過測定其折射率來確定，配置后可以進行高溫高壓的滅菌。可根據需要配置成不同密度的梯度離心液，主要用于脂蛋白的分離，也可用于淋巴細胞分離純化。^【7,8】

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供應商              品名                        貨號           規格

Axis-Shield      Nycodenz（粉劑）         AS1002424      1x500g

Axis-Shield  LymphoprepTM  分離管（即用型）   AS1019818    18Tubes x10ml

Axis-Shield   OptiPrepTM  分離液（即用型）AS1114542      1x250ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分離液（即用型）AS1114544    1x250ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分離液（即用型）AS1114545    4x250ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分離液（即用型）AS1114547    1x500ml

Axis-Shield  LymphoprepTM  分離液（即用型）AS1114547     6x500ml

Axis-Shield  NycoPrepTM 1.077  分離液（即用型）AS1114550  4x250ml

Axis-Shield  NycoPrepTM 1.077  分離液（即用型）AS1114551   1x250ml

2、羥*基淀粉（HES）離心沉淀法

HES是一種由高分子量支鏈淀粉經降解、羥*基化并進一步加工處理后制成的血漿代用品^【9】。自然狀態下，HES與紅細胞膜上的負電荷結合，使紅細胞彼此以凹面相貼聚集而下沉，與血漿及單個核細胞形成清晰的界面。如果HES與外周血混合物經低速離心可加快紅細胞的下沉，便于吸取含單核細胞層，使PBMC的分離過程簡單化。該方法分離PBMC操作簡便，成本低廉，分離細胞數量與密度梯度離心方法相當。然而該方法分離的細胞質量有待進一步提高。^【10-12】

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國內多家血漿代用品供應商如湖北武漢康寶泰精細化工有限公司可以獲得。

3、基于免疫技術的淋巴細胞分離法

目前多家生物制品公司均開發出的基于抗原抗體特異性結合的淋巴細胞分離試劑盒，主要有免疫磁珠分離法、流式細胞分選法^【13,14】。這些試劑盒能特異性分離外周血或其它組織中的單一淋巴細胞類型，操作簡便，所得細胞純度高，可直接用于下游分子生物學實驗。然而該法基于抗體技術，因此成本高，還未成為目前的主流淋巴細胞分離方法。

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Stem cell   EasySep™ Magnet全淋巴細胞富集試劑盒    19961HLA

Stem cell   EasySep™ MagnetT細胞富集試劑盒         19951HLA

Stem cell   EasySep™ MagnetB細胞富集試劑盒         19954HLA

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主要參考文獻：

1. Separation of human lymphocytes from citrated blood by density gradient (NycoPrep) centrifugation: monocyte depletion depending upon activation of membrane potassium channels. Bøyum A, Brincker Fjerdingstad H, Martinsen I, Lea T, Løvhaug D. Scand J Immunol. 2002 Jul;56(1):76-84.

2. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Bøyum A, Løvhaug D, Tresland L, Nordlie EM. Scand J Immunol. 1991 Dec;34(6):697-712.

3. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Bøyum A.

Scand J Immunol. 1976 Jun;Suppl 5:9-15.

4. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. de Almeida MC, Silva AC, Barral A, Barral Netto M. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3

5. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.

Pino PA, Cardona AE. J Vis Exp. 2011 Feb 2;(48). pii: 2348.

Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3.

6. Iodixanol梯度離心法分離脂蛋白. 黨美林，林元喜. 《第七屆海峽兩岸心血管科學研討會論文集》.2009年 

7. Su-Ting Chen, Jia-Yun Li, Yi Zhang. Recombinant MPT83 Derived from Mycobacterium tuberculosis Induces Cytokine Production and Upregulates  the Function of Mouse Macrophages through TLR2. The Journal of Immunology, 2012, 188: 668–677

8.Xingui Tian, Xiaobo Su, Xiao Li. Protection against Enterovirus 71 with Neutralizing Epitope Incorporation within Adenovirus Type 3 Hexon. PLoS ONE. July 2012,Volume 7, Issue 7 , e41381.

9.Forster H.Physical and chemical properties of hydroxyethylstarch.Plasˉma Volume Expansion，1992，105-121.

10.Rubinstein P，Dobrila L，Rosenfield RE，et al.Processing and cryopˉreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution.Proc Natl Acad Sci，1995，92:10119-10122.

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12. 對外周血單個核細胞分離方法探討. 韓亞萍 劉源 章莉莉 劉婷 李軍 黃祖瑚 .中華現代臨床醫學雜志 2003年11月.1(9)

13.181-P: A rapid method to enrich specific lymphocyte populations (T cells, B cells, total lymphocytes) from whole blood. Karina L. McQueen, Jenna L. Warren, Allen C. Eaves, Terry E. Thomas.Human Immunology. Volume 68(1), Supplement: S106. 33rd Annual ASHI Meeting Abstracts October 2007

14. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Dagur PK, McCoy JP Jr. Curr Protoc Cytom. 2015 Jul 1;73:5.1.1-5.1.16