aatbio酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

ELISA或酶聯(lián)免疫吸附測定法是一種基于板的免疫測定法，用于檢測和定量生物分子，例如抗體，蛋白質(zhì)，激素或肽，以及表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-核酸相互作用。在ELISA中，通常將感興趣的靶標(biāo)（通常是抗原）固定在固體表面上，然后用與諸如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的酶綴合的抗體進行探測。通過與被酶催化的底物孵育來實現(xiàn)定量，從而產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。

目錄

1. ELISA概述
   1. 1.1 直接與間接檢測
2. ELISA格式
   1. 2.1 直接ELISA
   2. 2.2 間接ELISA
   3. 2.2 夾心ELISA
3. ELISA抗體和其他探針
   1. 3.1 HRP和多HRP二抗
   2. 3.2 HRP和AP鏈霉親和素結(jié)合物
4. ELISA底物和檢測策略
   1. 4.1 比色ELISA底物
   2. 4.1 熒光ELISA底物
   3. 4.1 化學(xué)發(fā)光ELISA底物
5. 產(chǎn)品訂購信息

ELISA概述（酶聯(lián)免疫吸附測定）

ELISA測定法通常在96孔聚苯乙烯微量滴定板中進行。這些板被設(shè)計成通常通過直接吸附到微量滴定板的表面上或間接地通過預(yù)先包被的“捕獲”抗體間接地結(jié)合和固定抗原。固定后，將一抗引入樣品中，與抗原形成免疫復(fù)合物。一級抗體可以共價標(biāo)記到酶（例如HRP）上，或者如果一級抗體被生物素標(biāo)記，則一級抗體本身可以使用酶標(biāo)記的二級抗體或鏈霉親和素偶聯(lián)物間接檢測。通過與合適的底物孵育來評估共軛酶的活性，從而實現(xiàn)檢測，該底物會產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。基材在靈敏度和與成像設(shè)備的兼容性方面各不相同，

直接與間接檢測

在ELISA中檢測一級抗體-抗原復(fù)合物的方法可以是直接的或間接的（圖1）。在直接檢測方法中，與報告酶（例如HRP或AP）綴合的單一一抗用于一步步驟中，以直接檢測靶抗原。通過間接檢測，可以依次使用雙抗體系統(tǒng)檢測目標(biāo)靶標(biāo)。首先，將樣品與針對目標(biāo)抗原的未標(biāo)記一抗孵育。然后，使用一抗特異的酶標(biāo)二抗檢測其存在，從而檢測靶抗原。如果使用生物素化的一抗檢測抗原，則使用酶標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素偶聯(lián)物作為您的第二檢測試劑。

確定使用哪種檢測方法取決于靶抗原的表達水平。為了檢測高度表達的抗原，直接檢測是合適的方法。當(dāng)靈敏度至關(guān)重要時，例如檢測低豐度靶標(biāo)或表達不良的抗原，請使用間接檢測方法來增強信號。

圖1.使用靶標(biāo)特異性抗體進行直接和間接抗原檢測的圖示。

ELISA格式

盡管存在ELISA的幾種變體，但它們具有相似的關(guān)鍵一步，即抗原固定。這可以通過抗原直接吸附到孔表面來實現(xiàn)，也可以使用“捕獲”抗體間接實現(xiàn)。在后一種方法中，固定在孔表面的“捕獲”抗體結(jié)合并保留抗原。固定后，酶聯(lián)抗體可用于檢測和量化目標(biāo)靶標(biāo)。考慮到所有因素，ELISA通常分為三類：

• 直接ELISA
• 間接ELISA
• 夾心ELISA

直接ELISA

在直接ELISA中，抗原通過被動吸附直接固定在板的表面，并使用HRP標(biāo)記的一抗進行檢測。將無色底物引入樣品，該底物與酶結(jié)合物反應(yīng)，并產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇，該副產(chǎn)物可以是比色的，化學(xué)發(fā)光的或熒光的。信號產(chǎn)生的大小與樣品中抗原的數(shù)量成正比。在所有ELISA格式中，直接ELISA分析簡單，執(zhí)行快，但靈敏度低。

方案：比色直接ELISA

1. 用檢測抗原包被ELISA板，密封板并在4°C下孵育過夜
2. 去除涂料溶液并用所需的緩沖液沖洗板兩次
3. 在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時
4. 用緩沖液洗板3次
5. 與HRP標(biāo)記的一抗體在室溫下孵育1小時
6. 用緩沖液洗板4次
7. 在室溫下用ReadiUse™TMB底物溶液（貨號11012）接種板15-30分鐘。
8. 用ELISA酶標(biāo)儀測量650 nm處的吸光度信號

圖2.直接ELISA圖解。

間接ELISA

間接ELISA本質(zhì)上是直接ELISA的修改版本。在間接ELISA中，用于檢測抗原的一抗是未偶聯(lián)的。取而代之的是，對一級抗體的宿主物種具有反應(yīng)性的酶標(biāo)二級抗體被用于檢測一級抗體-抗原復(fù)合物（間接檢測抗原）。將無色底物引入樣品，該底物與酶結(jié)合物反應(yīng)，并產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇，該副產(chǎn)物可以是比色的，化學(xué)發(fā)光的或熒光的。信號產(chǎn)生的大小與樣品中抗原的數(shù)量成正比。與直接ELISA相比，使用輔助檢測試劑具有明顯的優(yōu)勢，即信號放大。

方案：比色間接ELISA

1. 用檢測抗原包被ELISA板，密封板并在4°C下孵育過夜
2. 去除涂料溶液并用所需的緩沖液沖洗板兩次
3. 在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時
4. 用緩沖液洗板2次
5. 與未偶聯(lián)的一抗在室溫下孵育1小時
6. 用緩沖液洗板4次
7. 在室溫下與HRP標(biāo)記的二抗（在封閉緩沖液中）孵育1小時
8. 用緩沖液洗板4次
9. 在室溫下用ReadiUse™TMB底物溶液（貨號11012）接種板15-30分鐘。
10. 用ELISA酶標(biāo)儀測量650 nm處的吸光度信號

圖3.間接ELISA圖解。

夾心ELISA

夾心ELISA分析是常用的ELISA形式。它需要使用匹配的抗體對，從而每種抗體對抗原上不同的非重疊表位具有特異性。首先將一種抗體，稱為捕獲抗體，包被在多孔微量滴定板的表面上，以促進靶抗原的固定。然后，第二種抗體（稱為檢測抗體）與捕獲抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合（因此，術(shù)語“三明治”因為抗原被結(jié)合在匹配的抗體對之間）。添加對檢測抗體（而非捕獲抗體）具有特異性的酶標(biāo)記的第二抗體偶聯(lián)物。一旦二級抗體與檢測抗體結(jié)合，

方案：比色夾心ELISA

1. 用捕獲抗體，密封板包被PCV微量滴定板的孔，并在4°C下孵育過夜
2. 去除涂料溶液并用所需的緩沖液沖洗板兩次
3. 在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時
4. 用所需緩沖液洗板2次
5. 向每個孔中添加樣品，在37°C下孵育2小時
6. 取出樣品并用所需緩沖液洗板2次
7. 與未偶聯(lián)的檢測抗體在室溫下孵育1小時
8. 用所需緩沖液洗板4次
9. 在室溫下與HRP標(biāo)記的二抗（在封閉緩沖液中）孵育1小時
10. 用所需緩沖液洗板4次
11. 在室溫下用ReadiUse™TMB底物溶液（貨號11012）接種板15-30分鐘。
12. 用ELISA酶標(biāo)儀測量650 nm處的吸光度信號

圖4.夾心ELISA圖。

ELISA抗體和其他探針

單克隆抗體，多克隆抗體或二者的組合通常在ELISA分析中用作檢測或捕獲抗體。單克隆抗體固有地是單價的，對每個抗原的單個表位具有特異性。在所有ELISA格式中，單克隆抗體通常用作檢測抗體。因為它們很少與其他蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，所以它們不太可能產(chǎn)生非特異性信號。相反，作為抗體的復(fù)雜混合物的多克隆抗體識別在單個抗原中發(fā)現(xiàn)的多個表位。盡管它們經(jīng)常在夾心ELISA分析中用作“捕獲抗體”，以拉低盡可能多的抗原，但它們也可用作檢測抗體。多克隆抗體極易發(fā)生批次間變化，

ELISA二級探針

酶聯(lián)二抗或鏈霉親和素共軛物經(jīng)常用于間接和夾心ELISA分析中。它們放大弱信號的能力使其在檢測表達不良的抗原方面具有優(yōu)勢。

HRP和多HRP二抗

辣根過氧化物酶（（HRP，目錄號11025通常與第二抗體或抗生蛋白鏈菌素偶聯(lián)，用于間接或夾心ELISA分析。HRP作為ELISA報告基因的廣泛采用主要是由于三個因素。首先，HRP具有擴增弱信號和增強表達不良抗原的可檢測性的能力。其次，與其他報告酶（例如堿性磷酸酶（?140 kDa））相比，HRP的尺寸相對較小（?44 kDa），進一步提高了細(xì)胞內(nèi)滲透到樣品中的能力，減少了空間位阻，并使免疫反應(yīng)性損失小化。第三，HRP的高周轉(zhuǎn)率和良好的穩(wěn)定性可實現(xiàn)快速而強大的信號生成。AAT Bioquest提供與HRP和poly-HRP偶聯(lián)的高度純化和交叉吸附的第二抗體。MegaWox™聚HRP二級結(jié)合物旨在在ELISA分析中提供高水平的靈敏度和低背景。在樣品量有限或目標(biāo)分子表達較差的免疫分析中使用MegaWox™聚HRP結(jié)合物。

HRP和AP鏈霉親和素結(jié)合物

當(dāng)用于檢測抗原的一抗被生物素分子標(biāo)記時，酶標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素結(jié)合物可用于ELISA中。鏈霉親和素的四聚體構(gòu)象使其能夠以高親和力和選擇性結(jié)合多達四個生物素分子。這種多樣性使得能夠放大弱信號，并提高了對中，低豐度目標(biāo)的檢測靈敏度。鏈霉親和素以現(xiàn)成的形式與HRP或AP結(jié)合。

ELISA底物和檢測策略

所有ELISA分析的后一步是添加酶底物的檢測步驟。酶（例如HRP或AP）將底物催化成可測量的副產(chǎn)物，并且產(chǎn)生的信號強度與樣品中的抗原量成正比。ELISA底物在易用性，靈敏度和與成像設(shè)備（例如分光光度計，熒光計和發(fā)光計）的兼容性方面有所不同。

比色ELISA底物

比色（或生色）底物與酶反應(yīng)生成可觀察到的有色副產(chǎn)物，可以使用吸光度板讀數(shù)器進行測量。AAT Bioquest提供辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）的比色底物，其靈敏度和光密度范圍都很大。

熒光ELISA底物

熒光（或熒光）底物與酶反應(yīng)生成高度熒光的副產(chǎn)物，可使用熒光酶標(biāo)儀進行測量。光激發(fā)后的光子發(fā)射程度與樣品中的抗原量成正比。AAT Bioquest提供了辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）的熒光底物，其靈敏度和熒光特性均在此范圍內(nèi)。

化學(xué)發(fā)光ELISA底物

化學(xué)發(fā)光底物與酶反應(yīng)生成發(fā)光副產(chǎn)物，可以使用發(fā)光計進行測量。由于光子的發(fā)射是化學(xué)反應(yīng)而非光激發(fā)的結(jié)果，因此背景干擾小。AAT Bioquest提供了辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）的化學(xué)發(fā)光底物，其敏感性和化學(xué)發(fā)光特性均在這一范圍內(nèi)。

產(chǎn)品訂購信息

通用ELISA試劑盒